革蘭氏染色和抗酸染色液
革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的種鑒別染色法，1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。未經(jīng)染色之細(xì)菌，由于其與周圍環(huán)境折光率差別甚小，故在顯微鏡下難觀察。染色后細(xì)菌與環(huán)境形成鮮明對(duì)比，可以清楚地觀察到細(xì)菌的形態(tài)、排列及某些結(jié)構(gòu)特征，而用以分類鑒定。革蘭氏染色屬?gòu)?fù)染法。
步驟
革蘭氏染色法般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個(gè)步驟，
具體操作方法是：
1）涂片固定。
2）草酸銨結(jié)晶紫染1分鐘。
3）自來(lái)水沖洗。
4）加碘液覆蓋涂面染約1分鐘。
5）水洗，用吸水紙吸去水分。
6）加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動(dòng)進(jìn)行脫色，20秒后水洗，吸去水分。
7）蕃紅染色液（稀）染1分鐘后，自來(lái)水沖洗。干燥，鏡檢。
原理
通過(guò)結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，革蘭氏陽(yáng)性菌由于其細(xì)胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時(shí)，因失水反而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會(huì)出現(xiàn)縫隙，
因此能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi)，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細(xì)胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出，因此通過(guò)乙醇脫色后仍呈無(wú)色，再經(jīng)沙黃等紅色染料復(fù)染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。
染色的差異主要是由于陰性與陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁的差異所引起的。
1.革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞壁 G+細(xì)菌細(xì)胞壁具有較厚（20-80nm）而致密的肽聚糖層，多達(dá)50層，占細(xì)胞壁成分的40%～95%，它同細(xì)胞膜的外層緊密相連。有的G+細(xì)菌細(xì)胞壁中含有磷壁酸（teichoic-acid），也稱胞壁質(zhì)（murein），它是甘油和核糖醇的聚合物，磷壁酸通常以糖或氨基酸的酯而存在。由于磷壁酸帶負(fù)電荷，它在細(xì)胞表面能調(diào)節(jié)陽(yáng)離子濃度。磷壁酸與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)，細(xì)胞生長(zhǎng)中有自溶素（autolysins）酶類起作用，磷壁酸對(duì)自溶素有調(diào)節(jié)功能，阻止胞壁過(guò)度降解和壁溶。 如果細(xì)胞壁的肽聚糖層被消溶，G+細(xì)胞成為原生質(zhì)體（protoplasts），細(xì)胞壁不復(fù)存在，而只存留細(xì)胞膜。除鏈球菌外，大多數(shù)G+細(xì)菌細(xì)胞壁中含少蛋白質(zhì)。
2.革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁 G—細(xì)菌細(xì)胞壁比G+細(xì)菌細(xì)胞壁薄（15～20nm）而結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，分外膜（outer membrane）和肽聚糖層（2～3nm）。在細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜之間有個(gè)明顯的空間，稱為壁膜間隙（periplasmic space）。 外膜 G—細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的基本成分是脂多糖（lipopolysaccharide,LPS），它同細(xì)胞質(zhì)膜相同之處也是雙層類脂，但除磷脂外還含有多糖和蛋白質(zhì)。 LPS的多糖部分包括核心多糖和O-特異多糖。O-特異多糖由重復(fù)分支的碳水化合物分子組成，含有已糖（葡萄糖、半乳糖和鼠李糖）和二脫氧已糖。由于糖的種類不同，使各種G—細(xì)胞具有不同特性的LPS。核心多糖（corepolysaccharide）的主要組分是酮脫氧辛酸（ketodeoxyoctonate, KDO）。外膜中還含有幾種蛋白，如脂蛋白、通透蛋白。有些蛋白具有通孔作用（porin），調(diào)控外界分子進(jìn)入細(xì)胞；有的蛋白分子可以作為噬菌體的受體；許多G—細(xì)菌對(duì)高等生物有致病性是由LPS的成分決定的，它的毒性組分常稱為內(nèi)毒素（endotoxins）。 肽聚糖層 G—細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖層很薄，在大腸桿菌和其它細(xì)菌中僅有單層。
肽聚糖層和外膜的內(nèi)層之間通過(guò)脂蛋白連接起來(lái)。 壁膜間隙 G—細(xì)菌細(xì)胞壁的外膜與細(xì)胞質(zhì)膜之間存在明顯的壁膜間隙，層薄的肽聚糖處于其間，肽聚糖層和細(xì)胞質(zhì)膜之間的間隙較寬，肽聚糖層至外膜之間的間隙較窄。大腸桿菌的壁膜間隙寬度為12～15nm，呈膠胨態(tài)。其間含有三類蛋白質(zhì)：水解酶，催化食物的初步降解；結(jié)合蛋白，啟動(dòng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程；化學(xué)受體（chemoreceptors），在趨化性中起作用的蛋白。
染色結(jié)果
革蘭氏陽(yáng)性菌呈藍(lán)紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。
抗酸染色法acid－fast staining method 1882年由埃利希（F．Ehrlich）創(chuàng)并經(jīng)F．齊爾（Ziehl）改進(jìn)而創(chuàng)造出的細(xì)菌染色法。
抗酸染色的原理
分枝桿菌的細(xì)胞壁內(nèi)含有大量的脂質(zhì)，包圍在肽聚糖的外面，所以分枝桿菌般不易著色，要經(jīng)過(guò)加熱和延長(zhǎng)染色時(shí)間來(lái)促使其著色。但分枝桿菌中的分枝菌酸與染料結(jié)合后，就很難被酸性脫色劑脫色，故名抗酸染色。
齊-尼氏抗酸染色法是在加熱條件下使分枝菌酸與石炭酸復(fù)紅牢固結(jié)合成復(fù)合物，用鹽酸酒精處理也不脫色。當(dāng)再加堿性美蘭復(fù)染后，分枝桿菌仍然為紅色，而其他細(xì)菌及背景中的物質(zhì)為藍(lán)色。
抗酸染色般步驟
1）初染 用玻片夾夾持涂片標(biāo)本，滴加石炭酸復(fù)紅2-3滴，在火焰高處徐徐加熱，切勿沸騰，出現(xiàn)蒸汽即暫時(shí)離開，若染液蒸發(fā)減少，應(yīng)再加染液，以免干涸，加熱3-5分鐘，待標(biāo)本冷卻后用水沖洗。
2）脫色 3%鹽酸酒精脫色30秒~1分鐘；用水沖洗。
3）復(fù)染 用堿性美蘭溶液復(fù)染1分鐘，水洗，用吸水紙吸干后用油鏡觀察。
抗酸染色的染液配制
1、石炭酸復(fù)紅 堿性復(fù)紅酒精飽和溶液 10mL 5%石炭酸 90mL
2、3%鹽酸酒精 濃鹽酸 3mL 95%酒精97mL
3、呂氏美蘭液 美蘭酒精飽和液 30mL 氫氧化鉀（1:10000）100mL
