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革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的種重要的鑒別方法，而實(shí)驗(yàn)成功率低，常常出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果，對(duì)初學(xué)者來(lái)說(shuō)難度較大。因此，我們選取大腸桿菌作為G代表，枯草芽孢桿菌作為G代表，分析影響革蘭氏染色結(jié)果的各種因素，提高染色結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.實(shí)驗(yàn)材料

1.1菌種：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌。

1.2試劑：草酸銨結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95%乙醇、番紅染液。

2.實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果

2.1菌齡對(duì)染色結(jié)果的影響

革蘭氏染色要求菌種被染色時(shí)處于活躍生長(zhǎng)期。大腸桿菌的活躍生長(zhǎng)期為24h左右，枯草芽孢桿菌活躍生長(zhǎng)期為在14～16h，故對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的菌種分別選擇10個(gè)時(shí)間段進(jìn)行革蘭氏染色觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)染色結(jié)果影響較大，不同菌種對(duì)培養(yǎng)時(shí)間有不同要求。處于活躍生長(zhǎng)期的菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)為典型，能正確反映染色的結(jié)果。其中，大腸桿菌培養(yǎng)24h左右為宜，而枯草芽孢桿菌培養(yǎng)15h左右為宜。

2.2涂片厚度對(duì)染色結(jié)果的影響

用直徑3mm的接種環(huán)分別挑起培養(yǎng)24h左右的大腸桿菌和培養(yǎng)15h左右的枯草芽孢桿菌滿環(huán)、半環(huán)、更少量涂片，從中央向外圍涂開(kāi)，使細(xì)菌在小滴生理鹽水中涂成直徑約1cm的菌膜，堆積密度由濃厚到均勻分散，作革蘭氏染色觀察。結(jié)果顯示：涂片濃厚時(shí)，大腸桿菌因密集脫色不完全而呈陽(yáng)性反應(yīng)，枯草芽孢雖呈陽(yáng)性但是染色均勻度欠佳；涂片太薄，菌體過(guò)于稀少，觀察時(shí)尋找視野較麻煩。因此，只有在菌膜厚度均勻分散、肉眼能見(jiàn)無(wú)菌生理鹽水稍顯渾濁時(shí)，才能得到較佳的染色結(jié)果。

2.3媒染時(shí)間對(duì)染色結(jié)果的影響

將培養(yǎng)24h左右的大腸桿菌和培養(yǎng)15h左右的枯草芽孢桿菌革蘭氏染色，碘液作為媒染劑，覆蓋時(shí)間分別為30s、60s、90s、120s。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn)，媒染時(shí)間過(guò)短，不利于結(jié)晶紫—碘的復(fù)合物與細(xì)胞之間的結(jié)合，可能造成枯草芽孢桿菌（G）呈假陰性的結(jié)果，但對(duì)大腸桿菌（G）無(wú)影響；反之，媒染時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，結(jié)合過(guò)于牢固，容易造成大腸桿菌（G）假陽(yáng)性的結(jié)果，但對(duì)枯草芽孢桿菌（G）影響非常小。因此，媒染時(shí)間應(yīng)控制在60s為宜。

2.4乙醇脫色對(duì)染色結(jié)果的影響

脫色是影響革蘭氏染色的關(guān)鍵步驟，脫色時(shí)間直接關(guān)系到染色結(jié)果的準(zhǔn)確性。我們選擇10s至60s的脫色范圍，分6個(gè)時(shí)間分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可見(jiàn)，脫色程度不夠，大腸桿菌（G）可被染成假陽(yáng)性，對(duì)枯草芽孢桿菌（G）影響較小；脫色過(guò)度，枯草芽孢桿菌（G）容易成假陰性，對(duì)大腸桿菌（G）影響較小。這是由于酒精脫色時(shí)間長(zhǎng)使得細(xì)胞壁中脂類物質(zhì)易被溶解，細(xì)胞通透性增大，導(dǎo)致結(jié)晶紫—碘復(fù)合物易被抽提出來(lái)；反之，脫色時(shí)間短，復(fù)合物就不易從細(xì)胞壁中逸出，而兩種菌種化學(xué)組成有差別，染色受影響程度不樣。因此，革蘭氏染色時(shí)，定要嚴(yán)格控制酒精脫色時(shí)間，般以25～30s為宜。

3.結(jié)果分析

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)和分析，我們認(rèn)為菌齡、細(xì)菌密集程度、媒染時(shí)間、酒精脫色程度這幾個(gè)因素都會(huì)影響革蘭氏染色結(jié)果的正確性，同時(shí)還受干燥、固定等操作的影響。因此在進(jìn)行革蘭氏染色液實(shí)驗(yàn)教學(xué)和科研工作中，除操作正確適當(dāng)外，更重要的是選擇適合的菌齡和準(zhǔn)確把握脫色時(shí)間，這樣才能保證染色結(jié)果的正確性。