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革蘭氏染色液一般包括初染、媒染、脫色、復染四個步驟。具體操作方法如下:

(1)固定載玻片。在無菌操作條件下，用接種環將少量細菌均勻地涂在干凈的載玻片上，在火焰上加熱殺滅菌株并粘附固定。

草酸銨結晶紫染1分鐘；

(3)用自來水沖洗，去除浮色。

(4)用碘-碘化鉀溶液感染1分鐘，傾倒多余溶液。

(5)乙醇(95%)或丙酮酸等中性脫色劑脫色30秒，革蘭氏陽性菌不掉色呈紫色，革蘭氏陰性菌褪色無色。酒精脫色是整個過程中最關鍵的一步。

(6)番紅染液或沙黃復染30秒，革蘭氏陽性菌仍呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌是有區別的。