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細菌先經堿性染料結晶紫染色，再經碘液媒染（以增加染料與細胞的親和力）后，用酒精或丙酮脫色，再用復染色劑染色。不被脫色而保持原顏色者為革蘭紙陽性菌（G+）；被脫色后又被染上復染劑的顏色者為革蘭氏陽性菌（G-）。此法可將細菌分為兩大類。

革蘭氏染色液的機理主要是利用兩類細菌的細胞壁成分和結構不同。革蘭氏陰性菌的細胞壁中含有較多的類脂質，而肽聚糖的含量較少。當用乙醇或丙酮脫色時，類脂質被溶解，增加了細胞壁的通透性，使初染后的結晶紫和碘的復合物易于滲出，結果細胞被脫色，經復染后，又染上復染液的顏色；而革蘭氏陽性菌細胞壁中肽聚糖的含量多且交聯度大，類脂質含量少，經乙醇或丙酮洗脫后，肽聚糖層的孔徑變小，通透性降低，因此，細胞仍保留初染時的顏色。

【實驗材料、藥品及器具】

1、菌種：大腸桿菌（Escherichia coli），枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis），金黃色葡萄球菌（Staphylococeus auresu）

2、染液：草酸銨結晶紫液，革蘭氏碘液，95%的酒精，藏花紅液

3、器皿洗凈的載玻片6片、顯微鏡、酒精燈、接種環、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙、鑷子、玻璃缸、瓶裝蒸餾水

【實驗步驟】

1、取培養12-24h的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌分別涂片、固定。

2、加草酸銨結晶紫染色劑一滴，染色1分鐘。

3、傾去染液并用洗瓶裝水輕輕沖洗。

4、加碘液染1分鐘，水洗，然后用吸水紙吸干。

5、將載玻片略傾斜，滴加95%酒精脫色（洗至流下的酒精中無紫色時為止），然后水洗。

6、加藏花紅復染，染色30分鐘，水洗，用吸水紙吸干或烘干。

7、用油鏡鏡檢觀察。